作者简介

鄢盛恺，教授/研究员，临床检验诊断学专业硕士/博士研究生导师。先后任中国医学科学院北京协和医院检验科主任助理、中日友好医院检验科副主任（主持工作）、遵义医科大学“候鸟人才”专家。中国计量协会医学计量专业委员会副主任委员、中国生物化学与分子生物学会脂蛋白专业委员会常务委员、中国生物工程学会临床医学工程分会委员、中国电子学会生命电子学分会委员。担任全国高等医学院校医学检验技术专业本科规划教材《临床生物化学检验》主编（医药版）及国内外十余本专业杂志编委等。主要研究方向：动脉粥样硬化的基础与临床、临床检验方法学与关键技术、医学实验室认可与评定等。已在国内外各类专业杂志上发表论文150余篇，参加编写专著42本，主编17本。主持国际合作项目、国家863项目、国家自然科学基金面上项目等6项，获省部级以上科技成果二等奖2项次。

摘要

近年来质谱技术及其应用在我国发展十分迅速，在临床检验领域尤其是在临床生化检验方面的作用越来越明显，特别是液相层析-串联质谱法（LC-MS/MS）在各种生物样品中小分子化合物的定量检测及临床检验量值溯源方面应用越来越广泛。目前市场上已有诸多与不同类型质谱仪相配套的商品化检测试剂盒，为质谱技术的临床应用提供了全套解决方案。本文重点介绍质谱技术及其临床应用、我国商品化质谱分析仪与配套检测试剂及其质量评价方法，同时对该领域的量值溯源情况（包括参考方法和参考物质）进行简要总结。

质谱技术（mass spectrometry, MS）是一种鉴定技术，自诞生以来发展十分迅速，广泛应用于临床、生命科学等领域。层析-质谱联用技术具有高通量、高灵敏度、高专一性，所需样品量少，分析速度快，能够多组分同时分析的特点，非常适合于临床生物样品的分析。常用的技术有液相层析-质谱法（LC-MS）、气相层析-质谱法（GC-MS）等。其中液相层析-串联质谱法（LCMS/MS）在临床检验领域尤其是在临床生化检验方面的作用越来越明显，使得生化检验结果更加准确可靠，并在临床检验量值溯源方面发挥了巨大的作用[1]。与质谱仪相配套的商品化试剂盒生产，为质谱技术的临床应用提供了解决方案。本文重点介绍质谱技术及其临床应用、我国商品化质谱仪与配套检测试剂及其质量评价方法，同时对该领域的量值溯源情况（包括参考方法和参考物质）进行简要总结。

1、质谱技术及其临床应用

1.1 质谱技术

图1 质谱仪的结构组成示意图

Fig.1 The structure com position diagram of mass spectrometer

质谱技术通过将待测物质离子化，离子化碎片根据不同的质荷比进行分离和检测，然后依据保留时间和其丰度值进行定性和定量检测[1]，是临床检验中一种重要的检测分析技术；质谱仪主要由进样系统、电离系统（离子源）、质量分析系统、检测系统组成（图1）。

层析技术（chromatography）是基于各组分不同的理化性质，在固定相与流动相中具有不同的吸附性能和/或分配系数，当两相相对运动时不同组份在两相间进行反复多次分配，使不同组份有效分离。按分离机理可分为：分配层析、吸附层析、离子交换层析、空间排阻层析；根据流动相的不同可分为气相层析（GC）、液相层析（LC）[2]。LC-MS在临床实验室最先检测的项目是类固醇及有机酸[3];自从用于检测酰基肉碱诊断新生儿遗传代谢病（IEM）后，LC-MS在临床应用中凸显出强大的应用价值，特別是在特异性、灵敏度、多组分检测中具有更显著的优势，成为了临床质谱检测的重要组成部分。此外，还采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）、超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）、电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）、GC-MS等设备。由于临床检测样本基质比较复杂，且需要进行定量分析，三重四极杆等多重MS技术与层析技术的联用使得检测向高敏、可重复、定量方向发展，这也是目前临床实验室开展质谱检测的基础[5]。目前，临床实验室质谱检测常用的电离方式主要有3种：电喷雾电离（ESI）、大气压化学电离（APCI）及大气压光电离（APPI），其中ESI最为常用[6]。

1.2 质谱技术的临床应用

表1 LC-MS /M S技术临床检验项目汇总

Tab.1 Summary of clinical laboratory items of LC-MS /MS technology

质谱技术临床应用的发展离不开独立医学实验室和临床自建项目（LDT）的发展，尤其是LCMS/MS技术已成为国内外临床检验领域最富有生命力的新技术之一，广泛应用于激素、氨基酸、维生素、药物、新型生物标志物等分析检测（表1）[7]，目前，我国在该领域尚处于起步阶段，因此，该技术在临床诊断中具有巨大的潜力。

1.2.1 新生儿遗传代谢病筛查

遗传代谢病又称先天性代谢缺陷病（IEM）,是由遗传代谢途径缺陷而导致遗传代谢物质蓄积或重要生理物质缺乏引起相应临床症状的一类疾病。它涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、类固醇、维生素等多种物质的代谢异常，可导致多个系统受损[8]。美国于20世纪末首先将MS/MS引入临床实验室，并将LC-MS/MS用于新生儿筛查（NBS）[4]，目前该技术可在几分钟内分析近百种代谢物，检测35种遗传代谢病，是IEM筛查的重要手段，在国内外已广泛用于IEM筛查及其临床检测[9]。

1.2.2 维生素检测

根据物理性质可将维生素分为脂溶性维生素(A、D、E、K)和水溶性维生素(B族、C、叶酸和泛酸等)，其中维生素D的缺乏在普通人群极为常见。Zhang等[6]研究表明，LC-MS/MS可用于脂溶性维生素检测；林东子等[10]采用LC-MS/MS方法同时检测血清中19种(13种水溶性和6种脂溶性)维生素，结果显示该方法具有重现性好、精确度高等优点。由于LC-MS/MS具有特异性强、准确性高的特点，可同时检测25-羟基维生素D2[25(OH)D2]、25-羟基维生素D3[25(OH)D3]，被认为是评价维生素D营养状况的“金标准”测定法，此法在欧美发达国家的临床应用发展迅猛，检测数量最多，影响最大。

1.2.3 类固醇激素检测

类固醇激素又称为留体激素，包括雄性激素、雌性激素、孕激素、糖皮质激素和盐皮质激素，属于环戊烷多氢菲衍生物。目前检测类固醇激素的生物样本主要有血清、血桨、毛发、尿液、唾液、子宫内膜等[11]。CHEN等[12]使用LCMS/MS方法测量了不同女性群体血清中孕二醇-3-葡糖醛酸含量；BAE等[13]使用LC-MS/MS方法检测了9种类固醇激素，并且根据性别、年龄和青春期确定了这9种类固醇激素的参考区间。目前，该技术可实现同时准确测量100多种类固醇，包括睾酮、雌二醇和孕酮[14]。

1.2.4 治疗药物监测

治疗药物监测（TDM）主要针对治疗指数低、个体差异大的药物，其核心是以血药浓度为指标，优化和个体化调整用药方案，用于预防或减少药物产生的不良事件。目前LC-MS在TDM的应用几乎囊括了所有需要监测的药物，包括：免疫抑制剂，如环孢素A（CsA）、他克莫司（TAC）、西罗莫司（SIR）、依维莫司（EVR）和吗替麦考酚酯（MPF），抗病毒药、抗癲痫药、抗抑郁药、抗躁狂症药、抗真菌药、抗心律失常药、抗哮喘药、抗生素、抗肿瘤药及非法滥用药等[15、16]。DI等[17]使用LC-MS/MS同时测定了血液中327种药物，包括各种麻醉剂、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、四氢大麻酚和大量合成大麻素等新型精神活性物质。

1.2.5 毛发中药物检测

检测毛发中药物浓度可有效评估接触史和用药史，已在用药依从性、法医、环境毒理学、兴奋剂检测等多个领域进行应用[18]。AMELINE等[19]建立了检测头发中来曲唑含量的LC-MS方法，并广泛运用于兴奋剂事件的判断。内源性类固醇激素和内源性大麻素是人体应激反应的重要调节因子，VOEGEL等[20]使用LC-MS方法进行了头发中5种类固醇激素（可地松、皮质醇、雄烯二酮、睾酮、孕酮）和4种内源性大麻素（大麻酰胺、棕榈酰乙醇酰胺、2-花生醛酰甘油、油酰乙醇酰胺）的定量分析。JI等[21]使用LC-MS/MS方法测定了头发中12种精神药物及其代谢物。甲氨蝶呤（MTX），可用于治疗类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、癌症、免疫疾病等，KIM等[22]建立了检测患者毛发中MTX的LC-MS方法，具有良好的诊断性能，可应用于常规临床运用。

1.2.6 尿药筛查及多组分分析

对于非法药物滥用（如毒品）或处方药引起的药物过量（如用于慢性疼痛管理的阿片类镇痛药）情况，需要对疑似病例进行药物筛选和定量，目前通常采用LC-MS/MS方法进行尿药筛查。近年来此法也广泛应用于尿液的多组分分析。ARAUJO-CASTRO等[23]使用该方法进行尿液甾谱分析，全面、无创地评估了肾上腺类固醇的生成，可作为肾上腺偶发瘤评估的补充，并可用于原发性醛固酮增多症和肾上腺恶性肿瘤的诊断；LUEKE等[24]使用该方法检测尿液中的白三烯E4,可作为系统性肥大细胞增生症的生物标志物；FU等[25]使用该方法检测尿液中的游离脂质、总氧化脂质，可作为类风湿性关节炎的生物标志物。随着代谢组学的发展，快速检测尿液标志物的方法得到了发展，采用超高效液相层析-高分辨质谱（UPLC-HRMS）方法，可在30分钟内检测和量化近9000种独特的代谢物[26]。

2、我国临床质谱检测系统的现状

2.1 商品化质谱仪

用于临床检测的仪器需取得医疗器械注册证，目前国内已取得医疗器械注册证的质谱检测系统包括LC-MS、MALDI-TOF-MS、ICP-MS等。从2015年至2020年有14个LC-MS取得了医疗器械注册证，从2015年至2020年有15个MALDI-TOF-MS取得了医疗器械注册证，2020年有2个ICP-MS取得了医疗器械注册证（表2〜4）。

表2 国内取得医疗器械注册证的LC-MS类产品

Tab.2 LC-MS products with registration certificate for medical device in China

表3 国内取得医疗器械注册证的MALDI-TOF-MS产品

Tab.3 MALDI-TOF-MS products with registration certificate for medical device in China

表4 国内取得医疗器械注册证的ICP-MS类产品

Tab.4 ICP-MS products with registration certificate for medical device in China

表5 国内取得医疗器械注册证的质谱检测试剂盒

Tab.5 Mass spectrometry detection kits with registration certificate for medical device in China

2.2 质谱仪配套商品化检测试剂盒

与国外较早进行质谱仪相配套的商品化检测试剂盒生产相比，我国试剂研发起步较晚，但近年呈增长趋势。截至目前有21家临床质谱诊断试剂生产单位取得了医疗器械注册证（表5）,临床质谱检测试剂盒主要涉及项目有：IEM筛查、代谢物检查（氨基酸、脂肪酸）、类固醇激素检测、维生素检测、治疗药物监测等。

2.3 临床质谱检测试剂的质量评价

目前临床质谱检测试剂的质量评价方法主要有内部质量评价和外部质量评价。国际上LC-MS/MS方法验证的指导原则有美国食品与药品监督管理局（FDA）发布的《生物分析方法验证指南》和美国临床实验室标准化协会（CLSI）发布的C62-A、C50-A文件以及各类性能评估和测试的文件[27,28]；2017年中华医学会检验医学分会和国家卫生计生委临床检验中心联合发布了《液相色谱-质谱临床应用建议》[29]，2018年，中国医师协会检验医师分会临床质谱检验医学专业委员会发布了《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》[30]。各临床检验机构应根据以上评价标准对厂商试剂盒及LDT的性能指标（包括线性范围、正确度、精密度、检测限和定量限、携带污染、基质效应、测量不确定度等）进行系统的质量评价，以满足临床诊断需求。

近期，全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会（TC136）起草了关于《液相色谱-质谱法测定试剂盒通用要求》，规定了LC-MS检测试剂盒的相关术语和定义、要求、试验方法、标签、使用说明书、包装、运输和贮存，规定了试剂盒测定人体样本（全血、血清、血浆、尿液等）的重要技术指标参数，并给出相应的检验方法，未来上市的商品化试剂盒产品均须符合该标准。对于已经过全面的质量评价并应用于临床检测的项目，内部应做好室内质控，建议按标准-质控-样本-质控的顺序进行，质控符合要求才能发临床报告。

外部质量评价主要指实验室间质量评价和实验室比对活动。国家卫生健康委临床检验中心、上海市临床检验中心等机构，每年均对LC-MS测定项目进行包括正确度和常规实验室的室间质量评价。值得注意的是，正确度评价样本来源于临床（如冰冻人血清），采用参考方法定值，具有更高的正确度和相对小的基质效应，建议临床实验室尽量参加此类正确度评价活动。此外，临床实验室可根据自己的需要，跟有能力的实验室，尤其是参考实验室进行室间比对活动，以保障自己实验室测量结果准确可靠。

3、临床质谱检测系统的量值溯源

3.1 临床检验的量值溯源

量值溯源是通过一条具有规定不确定度的不间断比较链，使测量结果或测量标准能够与规定的参考标准一致，实现检验结果在时间、空间上具有可比性的目的，能够与国家标准或国际标准联系起来的一种特性，已成为临床检验面临的一个重要课题。临床检验结果的准确性主要通过校准实现量值溯源，而溯源的源头通常被称为参考系统[31,32]。

国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM），致力于向全球公布满足相关技术要求的国际参考物质、参考测量程序和参考测量实验室，是国际公认的“金标准”。截至2021年1月，我国有9家机构的93个项目进入JCTLM的参考服务列表（表6）[31]。近十多年来，尽管我国在临床检验量值溯源方面有了较大的发展，但与欧美等国家差距还较大。

表6 我国医学参考实验室进入JCTLM情况

T ab .6 Summary of Chinese medical reference laboratories entered of JCTLM

2020年新版ISO 17511明确了体外诊断产品制造商应承担起产品计量学溯源的责任，有义务向用户提供完整的包括患者样本结果的计量学溯源链；第8章明确要求“产品校准品的溯源性细节和相关信息要在技术文件中列出”[33]。制造商可根据新版ISO 17511提供的校准程序（图2），选择合适的一级参考测量程序，如同位素稀释质谱法与库仑法、滴定法、凝固点下降法和重量法等（能直接溯源至SI单位），根据JCTLM公布的临床检验项目测定的参考方法，制定临床检验产品的溯源链，从而保证临床检测结果的溯源性。

图2 IS0 17511完整的量值溯源图

Fig.2 The completely process metrological traceability of IS0 17511

3.2 LC-MS/MS检测系统量值溯源

国内市场目前可见的商品化质谱检测试剂盒大约有十余种，但绝大多数缺乏溯源性，其检测结果无法溯源至SI单位，很难保证测量结果的准确性。主要原因有以下几个方面：①除了维生素、激素等少数检测项目外，均无JCTLM认可的参考方法和参考物质；②国内开发临床质谱诊断试剂的相关公司，对溯源性的重视程度不够；③国内很多取得医疗器械注册证的产品，试剂盒组成仅包括校准品、内标液和质控品。流动相、萃取液、复溶液等还需另外配制，无法与质谱仪组成一个完整的检测系统，大多数临床实验室仍为LDT。

目前，JCTLM已发布临床检验领域相关的参考方法约50项，参考物质约200种，其中，LC-MS/MS作为参考方法检测的物质主要包括维生素、代谢小分子物质、类固醇激素、治疗性药物等。在维生素检测方面，仅有25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和叶酸三种可作为参考物质；美国国家标准与技术研究所（NIST）提供的参考物质SRM2972a，可用于25-羟基维生素D检测系统的校准；参考物质SRM972可作为正确度控制物质，用于验证25-羟基维生素D检测系统的正确度。在类固醇激素检测方面，可作为参考物质的有：醛固酮、雄烯二酮、皮质醇、雌二醇、雌三醇、睾酮、孕酮、雌酮；Chromsystems公司开发了类固醇激素试剂盒，而目前国内还没有类固醇激素临床质谱诊断试剂盒取得医疗器械注册证[34]。代谢物小分子物质在人体血清/血浆中的浓度比较高，可作为参考物质的有：肌酐、尿素、尿酸、葡萄糖、同型半胱氨酸、总胆固醇[35]；FU等[32]使用LC-MS/MS技术建立了胆汁酸的参考方法，可同步检测血清中21种初级和次级胆汁酸。在治疗性药物浓度监测方面，可作为参考物质的有：对乙酰氨基酚、洋地黄毒苷、地高辛、庆大霉素、拉莫三嗪、鲁米那、苯妥英、茶碱、托吡酯、万古霉素、卡马西平，此外，还有部分药物也是国际公认的参考物质，如NIST提供的参考物质SRM2381可用于校准吗啡和可待因检测系统、参考物质SRM 3063可用于校准地高辛检测系统、参考物质SRM1599可用于校准卡马西平检测系统[36]。

4、结束语

与现有免疫技术相比，LC-MS/MS具有灵敏、特异的优点，但也存在自动化低、仪器复杂、投资大等不足，在临床应用中还面临着不少的挑战。诸如：临床检验所需质谱仪及配套试剂的资质审批严格、产品报批周期长和成本高。液质联用技术相对复杂，所需专门的人才相对缺乏；临床检验中能够采用LC-MS/MS方法检测的物质不多，需进一步有针对性地研发专用检测试剂盒；检测标本需手工操作进行合理的前处理，自动化程度及检测通量尚需提高；越来越多的大分子蛋白/多肽在疾病诊断方面得到应用，LC-MS/MS无需特殊的抗体试剂，是检测翻译后修饰较好的工具，但限于蛋白富集技术、同位素标记的内标等限制尚未能实现临床常规检测C肽、胰岛素、糖化血红蛋白等大分子物质。此外，量值溯源与标准化的缺乏也是目前LC-MS/MS临床应用的另一个瓶颈。只有通过政府有关部门、生产厂商及供应商、临床实验室等多方的协调合作，加强具有中国特色质谱仪的研制、检测试剂盒商业化的开发，建立基于量值溯源的规范化检测程序，完善基于LC-MS/MS检测项目的参考区间等，将有助于进一步改进LC-MS/MS的临床应用现状。随着相关技术的不断发展，特别是一些技术瓶颈的逐步解决，相信LC-MS/MS在临床检验领域的应用前景会越来越好。

参考文献

略

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