气相色谱-质谱法测定大鼠肝脏中的39种脂肪酸

背景介绍

脂肪酸是细胞膜的重要组成成分,参与人体能量储存、细胞信号转导等代谢活动。肝脏是体内脂肪酸合成和代谢的主要场所。肝脏中脂肪酸的种类及含量不仅可以反映机体的健康现状,其变化还会影响机体疾病的转化。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者肝脏中十八烷酸与十六烷酸的含量比值与肝脏脂肪变性程度存在负相关关系,该含量比值越低,伴随着越严重的肝脏脂肪变性。Matsuzaka等的研究显示,肝脏中与脂肪酸延长相关的Elovl6酶被抑制后,棕榈酸盐转化为硬脂酸盐会减少,有利于改善胰岛素抵抗和降低心血管风险。肝脏中脂肪酸的检测对于开展更多疾病机理和预防的研究十分重要。

气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱法(GC-MS)是组织中脂肪酸检测最常用的方法,但现有的方法大多用于羊肉、蟹肉等食品类组织样品的检测。肝脏中脂肪酸的提取方法主要有氯仿-甲醇(1∶2, v/v)提取法、氢氧化钾-甲醇提取法等。提取得到的脂肪酸需进一步甲酯化后方可用GC或GC-MS检测。脂肪酸甲酯化方法有酸催化法(如硫酸-甲醇溶液为衍生化试剂)和碱催化法(如氢氧化钾-甲醇溶液为衍生化试剂)等。现有的方法通常需要0.1~5 g组织样本,仅能检测13~24种脂肪酸,且未能分离其中的同分异构体脂肪酸,难以满足临床诊断和实验研究的需要。本研究通过比较和优化脂肪酸提取方法、衍生化条件等,建立了使用更少肝脏样本量即能检测更多脂肪酸(特别是同分异构体脂肪酸)的分析方法。

全氟辛烷磺酸(PFOS)是一种持久性有机污染物,可经过食物、水源、土壤等途径进入体内,从而引起肝脏、神经、内分泌等毒性。PFOS暴露可影响肝脏中脂肪酸的代谢。本研究将建立的检测方法应用于健康SD大鼠和经口暴露PFOS的SD大鼠(PFOS暴露大鼠)的肝脏中脂肪酸的检测。与已有的方法相比,本方法能从SD大鼠中检测更多的脂肪酸,同时也可分离文献中未能分离的同分异构体脂肪酸。

标准溶液的配制

母液A:称取36种脂肪酸甲酯混合标准品200.0 mg,用二氯甲烷-正己烷(1∶2, v/v)(下文简称:稀释溶剂)定容至10 mL。母液B:分别称取C22∶3、C22∶4n6、C22∶5标准品各10.0 mg,混合后用稀释溶剂溶解并定容至10 mL。内标(IS)储备液:称取C19∶0标准品10.0 mg,用稀释溶剂溶解并定容至10 mL。质控储备液:称取十三烷酸和二十三烷酸标准品各10.0 mg,用正己烷-甲醇(1∶4, v/v)溶解并定容至10 mL。

用稀释溶剂将IS储备液稀释成50 μg/mL的IS标准工作液。取适量母液A与B混合后用稀释溶剂依次稀释,配制成含39种脂肪酸甲酯的系列标准工作液,取不同浓度的标准溶液各80 μL和IS标准工作液20 μL混合后由GC-MS测定。用正己烷-甲醇(1∶4, v/v)将质控储备液稀释为10、100、600 μg/mL的质控标准溶液。

实验方法

动物实验

8~10周的雄性SD大鼠8只,购自南方医科大学动物中心,于南方医科大学SPF动物实验部饲养(动物实验伦理审查号:L2018202)。大鼠适应性喂养1周后,随机分为对照组(健康SD大鼠)和PFOS暴露组,每组4只。灌胃剂量:PFOS暴露组为PFOS 5 mg/(kg·d),健康SD大鼠组为0.9%生理盐水5 mL/(kg·d)。暴露32天后,对动物以麻醉后放血的方式处以安乐死,处死后迅速剥离肝脏并称重。取部分肝脏进行病理切片,剩余的肝脏经液氮迅速冷冻后转入-80 ℃冰箱中保存,待测。

组织研磨

每10.0 mg肝脏组织加入生理盐水450 μL,混匀后放入钢珠,在-35 ℃的研磨仪中,以70 Hz的振动频率研磨1 min得到肝脏匀浆。

总脂肪酸的提取

取肝脏匀浆50 μL(相当于肝脏1.1 mg),加入纯水250 μL、氯仿-甲醇(1∶2, v/v)750 μL和氯仿250 μL,涡旋1.5 min,于4 ℃以13 000 r/min离心5 min,转移下层有机相至玻璃管中;向水相中加入氯仿250 μL,重复提取一次,合并两次提取液,氮气吹干,得干燥脂肪酸提取物。

脂肪酸甲酯化

向干燥脂肪酸提取物中加入含5%硫酸的甲醇溶液2 mL,密封后混匀,于100 ℃反应90 min。待反应瓶冷却至室温后,加入超纯水2 mL、正己烷2 mL,混匀后,以13 000 r/min离心5 min,取有机层,氮气吹干,加入正己烷80 μL和IS标准工作液20 μL,混匀,待GC-MS分析。

GC-MS分析条件

色谱条件:SP-2560色谱柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm,美国Supelco公司);升温程序:初始温度100 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升至240 ℃,保持30 min;进样口温度:230 ℃;分流比10∶1;载气:氦气(纯度大于99.999%),流量:1.0 mL/min;进样量:1 μL。

质谱条件:电子轰击电离(EI)源;离子源温度:250 ℃;接口温度:240 ℃;溶剂延迟4 min;扫描模式:全扫描;质谱扫描范围:m/z 33~450。

文章信息

色谱, 2023, 41(5): 443-449

DOI: 10.3724/SP.J.1123.2022.09014

吴瑛瑕, 牟燕, 刘佩珊, 张易天, 曾颖炫, 周枝凤*

南方医科大学公共卫生学院卫生检验检疫系,广东省热带病研究重点实验室,广东广州510515

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